Szlak Nrf2/ARE

1. Profil szlaku

1.1. Definicja i zakres

Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, kodowany przez gen NFE2L2) to czynnik transkrypcyjny sterujący odpowiedzią komórki na bodziec utleniający i elektrofilowy. Po aktywacji wiąże się z odcinkiem regulatorowym ARE (antioxidant response element), obecnym w promotorach kilkuset genów, i włącza ich ekspresję [2].

Zakres tej odpowiedzi jest szerszy, niż sugeruje nazwa. Obejmuje ona enzymy antyoksydacyjne, enzymy syntezy i regeneracji glutationu, enzymy II fazy biotransformacji, transportery III fazy, białka gospodarki żelazem oraz enzymy przemian metabolicznych. Nrf2 nie jest zatem wyłącznie „genem antyoksydacyjnym”, lecz koordynatorem obrony komórkowej jako całości.

1.2. Elementy składowe

1.3. Geny docelowe

Do najlepiej scharakteryzowanych należą: hemooksygenaza 1 (HO-1), reduktaza chinonowa NQO1, podjednostki ligazy glutamylocysteinowej wyznaczające tempo syntezy glutationu, transferazy glutationowe, reduktaza glutationowa, tioredoksyna i peroksyredoksyny, ferrytyna oraz transportery MRP [2, 8].

Zestawienie to pokazuje logikę układu: jedno zdarzenie regulacyjne zwiększa jednocześnie zdolność do neutralizacji utleniacza, do sprzęgania toksyny i do jej usunięcia z komórki. Właśnie dlatego szlak ten łączy w encyklopedii dwa obszary — redoks i detoksykację — opisywane dotąd osobno.

2. Mechanizmy i regulacja

2.1. Mechanizm czujnika

W warunkach spoczynkowych KEAP1 wiąże Nrf2 i kieruje go do degradacji w proteasomie; czas półtrwania czynnika wynosi wtedy kilkanaście minut. Utrzymuje to jego stężenie na niskim poziomie mimo stałej syntezy — układ jest więc gotowy do natychmiastowego działania, a nie budowany od zera po pojawieniu się bodźca.

Sam czujnik ma naturę chemiczną. KEAP1 zawiera liczne reszty cysteinowe o wysokiej reaktywności, które utleniają się lub tworzą wiązania kowalencyjne ze związkami elektrofilowymi. Modyfikacja zmienia kształt białka i uniemożliwia dalsze kierowanie Nrf2 do degradacji. Nowo syntetyzowany czynnik omija wtedy KEAP1, gromadzi się i przechodzi do jądra komórkowego, gdzie wraz z małym białkiem MAF wiąże się z sekwencją ARE [2].

Poszczególne cysteiny odpowiadają przy tym na różne bodźce, co tworzy rodzaj kodu chemicznego: sulforafan, chinony, metale ciężkie i nadtlenek wodoru modyfikują odmienne reszty i wywołują nieco odmienne profile odpowiedzi.

2.2. Dlaczego bodziec musi być umiarkowany

Aktywacja szlaku wymaga bodźca — bez niego układ pozostaje wyciszony. Jest to podstawa hormezy: łagodne, powtarzalne narażenie na czynnik lekko szkodliwy zwiększa odporność na narażenie silniejsze.

Wynika stąd wniosek sprzeczny z intuicją, ale spójny z danymi z hasła Enzymy antyoksydacyjne. Substancje roślinne uznawane za przeciwutleniacze mają zwykle znikomą zdolność wygaszania rodników w warunkach panujących w organizmie, a ich działanie polega na łagodnym drażnieniu KEAP1 i włączeniu obrony własnej komórki [1, 6]. Skuteczne usuwanie utleniaczy z zewnątrz osłabiałoby natomiast ten bodziec — i właśnie dlatego wysokie dawki przeciwutleniaczy przyjmowane okołotreningowo osłabiają adaptację wysiłkową [9].

2.3. Regulacja niezależna od KEAP1

Obraz uzupełniają drogi alternatywne. Kinaza GSK-3β kieruje Nrf2 do degradacji w mechanizmie niezależnym od KEAP1; wpływ mają także szlak PI3K/Akt, autofagia (przez białko p62 wiążące KEAP1) oraz zmiany epigenetyczne. Aktywność szlaku maleje z wiekiem, co jest jednym z lepiej udokumentowanych elementów starzenia komórkowego i tłumaczy, dlaczego ten sam bodziec wywołuje u osoby starszej słabszą odpowiedź obronną [2].

3. Zaburzenia i modyfikacja

3.1. Niedostateczna aktywność

Osłabienie odpowiedzi Nrf2 opisano w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc, chorobach neurodegeneracyjnych, przewlekłej chorobie nerek, stłuszczeniowej chorobie wątroby i w cukrzycy typu 2. W większości tych stanów pozostaje niejasne, czy stanowi ono przyczynę, czy następstwo procesu chorobowego — jest to główne ograniczenie interpretacyjne tego obszaru [2, 6].

Odrębnym przykładem jest stan przedrzucawkowy, w którym zaburzenia sygnalizacji Nrf2/KEAP1 w łożysku opisano wraz z nasilonym stresem oksydacyjnym; także tutaj kierunek zależności nie jest rozstrzygnięty [7].

3.2. Nadmierna aktywność — druga strona szlaku

Ta część hasła bywa pomijana w przekazie popularnym, a jest kluczowa dla oceny bezpieczeństwa suplementów „aktywujących Nrf2″.

Mutacje unieczynniające KEAP1 lub aktywujące NFE2L2 występują w części nowotworów płuca, przełyku, wątroby i pęcherza. Komórka nowotworowa z trwale włączonym szlakiem zyskuje przewagę: znosi własny, podwyższony poziom utleniaczy, przestawia metabolizm na szlaki sprzyjające proliferacji i staje się oporna na chemioterapię oraz radioterapię, których działanie opiera się w części na stresie oksydacyjnym [1].

Nrf2 jest zatem czynnikiem o działaniu dwoistym — chroni komórkę prawidłową przed transformacją nowotworową, a komórkę już przekształconą przed leczeniem. Z tego powodu w onkologii bada się zarówno aktywatory, jak i inhibitory tego szlaku.

3.3. Doświadczenia kliniczne — dwa pouczające niepowodzenia

Bardoksolon metylu. Silny, syntetyczny aktywator Nrf2 badano u chorych z cukrzycą typu 2 i przewlekłą chorobą nerek w stadium 4. Badanie obejmujące 2185 uczestników przerwano po medianie dziewięciu miesięcy: nie stwierdzono zmniejszenia ryzyka schyłkowej niewydolności nerek ani zgonu sercowo-naczyniowego, natomiast hospitalizacje z powodu niewydolności serca lub zgony z jej powodu wystąpiły u 96 osób w grupie leczonej wobec 55 w grupie placebo (HR 1,83; 95% CI 1,32–2,55) [5].

Sulforafan. W badaniu z randomizacją u zdrowych ochotników homogenat z kiełków brokułu nie zwiększył ekspresji genów antyoksydacyjnych w drogach oddechowych ani nie ograniczył napływu neutrofilów po ekspozycji na ozon. Autorzy uznali suplementację sulforafanem za mało obiecującą dla dalszych badań w tym wskazaniu [4].

Oba wyniki prowadzą do tego samego wniosku ogólnego: przekonujący mechanizm i wyniki badań komórkowych nie przesądzają o korzyści u człowieka, a silna aktywacja szlaku obronnego nie jest z definicji korzystna.

3.4. Jak zbadać

Nie istnieje badanie oceniające aktywność tego szlaku w praktyce klinicznej. W pracach naukowych stosuje się ocenę ekspresji genów docelowych (NQO1, HO-1) w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej, oznaczenia stężenia glutationu oraz — w badaniach nad sulforafanem — pomiar wydalanych z moczem koniugatów kwasu merkapturowego jako miary wchłoniętej dawki [3].

Oferty komercyjne opisywane jako „test aktywności Nrf2″ nie mają uzasadnienia diagnostycznego; brak dla nich zarówno standaryzacji, jak i punktów odcięcia prowadzących do decyzji terapeutycznej.

3.5. Modyfikacja behawioralna i dietetyczna

• Wysiłek fizyczny — powtarzalny bodziec utleniający jest najlepiej udokumentowanym fizjologicznym aktywatorem tego szlaku [9]
• Warzywa kapustne — brokuł, brukselka, jarmuż, rzeżucha; kiełki brokułu zawierają wielokrotnie więcej glukorafaniny niż dojrzałe warzywo [3]
• Sposób przygotowania — mirozynaza, enzym uwalniający sulforafan, jest wrażliwa na temperaturę; krótkie gotowanie na parze zachowuje jej aktywność, długie gotowanie ją niszczy [3]
• Gorczyca w postaci surowej — dodana do ugotowanych warzyw kapustnych przywraca aktywność mirozynazy
• Ekspozycja na ciepło (sauna) i zimno — bodźce hormetyczne opisywane jako aktywujące odpowiedzi obronne; dane u ludzi ograniczone
• Ograniczenie przewlekłego przeciążenia utleniającego — palenie, hiperglikemia i przewlekłe zapalenie wyczerpują zdolność odpowiedzi

3.6. Wsparcie suplementacyjne

Zastrzeżenie. Substancje wymienione poniżej są aktywatorami szlaku wykazanymi w modelach komórkowych i zwierzęcych. Przełożenie na punkty końcowe u ludzi jest znacznie słabsze, niż sugeruje popularność tej kategorii, a przykład bardoksolonu pokazuje, że silniejsza aktywacja nie oznacza większej korzyści [4, 5].

Trzy uwagi praktyczne.

1. Wartość sulforafanu zależy od postaci preparatu: glukorafanina bez mirozynazy wymaga przekształcenia przez bakterie jelitowe, co daje wielokrotnie mniejszą i bardzo zmienną dostępność [3].
2. Osoby w trakcie leczenia przeciwnowotworowego powinny uzgadniać stosowanie silnych aktywatorów tego szlaku z lekarzem prowadzącym — aktywacja Nrf2 sprzyja przeżyciu komórek nowotworowych i osłabia działanie części terapii [1].
3. Najtańszym i najlepiej udokumentowanym aktywatorem pozostaje regularny wysiłek fizyczny, a nie preparat [9].

4. Karta praktyczna

Jak to zbadać

Nie istnieje badanie kliniczne oceniające aktywność szlaku. W pracach naukowych stosuje się oznaczenia ekspresji genów docelowych (NQO1, HO-1) oraz pomiar metabolitów sulforafanu w moczu jako miarę dawki wchłoniętej [3]. Komercyjne „testy aktywności Nrf2″ nie mają standaryzacji ani punktów odcięcia.

Na co uważać

• Silniejsza aktywacja nie oznacza większej korzyści — badanie leku aktywującego przerwano z powodu wzrostu liczby zdarzeń sercowych [5].
• Trwale wysoka aktywność Nrf2 sprzyja przeżyciu komórek nowotworowych i oporności na leczenie [1].
• Sulforafan w badaniu u zdrowych ochotników nie wywołał oczekiwanej odpowiedzi genowej [4].
• Preparaty z glukorafaniną bez mirozynazy mają znacznie mniejszą i zmienną dostępność [3].
• Wysokie dawki przeciwutleniaczy okołotreningowych osłabiają bodziec aktywujący ten szlak [9].
• Długie gotowanie warzyw kapustnych niszczy enzym uwalniający sulforafan [3].