Kinazy białkowe

1. Profil

1.1. Zasada działania

Kinaza przenosi końcową resztę fosforanową z ATP na jedną z trzech reszt aminokwasowych zawierających grupę hydroksylową: serynę, treoninę lub tyrozynę. Reakcja wymaga jonu magnezu, który neutralizuje ładunki fosforanów ATP i umożliwia ich prawidłowe ustawienie w miejscu aktywnym.

Skutek przyłączenia jest nieproporcjonalny do wielkości zmiany chemicznej. Reszta fosforanowa wnosi dwa ładunki ujemne i tworzy nowe wiązania wodorowe, przez co białko zmienia kształt, a wraz z nim aktywność katalityczną, powinowactwo do partnerów lub umiejscowienie w komórce. Fosforylacja bywa też sygnałem do rozpoznania przez układ degradacji.

Trzy właściwości czynią z tej modyfikacji uniwersalny przełącznik:

• Odwracalność — fosfatazy usuwają resztę fosforanową, więc stan białka odzwierciedla bieżącą równowagę, a nie historię
• Szybkość — zmiana zachodzi w sekundach, bez potrzeby syntezy nowego białka
• Możliwość stopniowania — wiele białek ma kilkanaście miejsc fosforylacji, a ich kombinacja koduje różne stany czynnościowe

Ostatnia właściwość bywa pomijana, a ma znaczenie zasadnicze. Białko z dwudziestoma miejscami fosforylacji nie jest przełącznikiem dwustanowym, lecz elementem o wielu stanach pośrednich — dlatego ta sama cząsteczka może brać udział w kilku różnych szlakach, zachowując się w każdym inaczej.

1.2. Klasyfikacja

Zbiór wszystkich kinaz genomu nazywa się kinomem i liczy u człowieka ponad pięćset enzymów. Podstawowy podział opiera się na tym, którą resztę aminokwasową fosforylują.

Drugi podział, praktyczniejszy dla fizjologii, dotyczy sposobu aktywacji. Kinazy zależne od przekaźników drugiego rzędu — PKA od cAMP, PKG od cGMP, PKC od diacyloglicerolu i wapnia, CaMKII od kompleksu wapń–kalmodulina — stanowią bezpośrednie przedłużenie szlaków opisanych w haśle o cyklicznych nukleotydach. Kinazy czujnikowe reagują natomiast na stan metaboliczny komórki: AMPK na stosunek AMP do ATP, mTOR na dostępność aminokwasów i czynników wzrostu.

1.3. Rys historyczny

Fosforylację białek jako mechanizm regulacyjny opisali w latach pięćdziesiątych Edmond Fischer i Edwin Krebs, badając aktywację fosforylazy glikogenowej w mięśniu. Wykazali, że enzym przechodzi ze stanu nieczynnego w czynny nie przez zmianę ilości, lecz przez przyłączenie fosforanu — obserwacja ta była wówczas nowa i została nagrodzona Noblem dopiero w 1992 roku.

Drugim przełomem było odkrycie, że kinazy uczestniczą w powstawaniu nowotworów. Białko powstające z połączenia genów BCR i ABL w przewlekłej białaczce szpikowej okazało się kinazą tyrozynową o trwale włączonej aktywności. Opracowany przeciw niej imatynib, wprowadzony w 2001 roku, zamienił chorobę o kilkuletnim rokowaniu w schorzenie przewlekłe i otworzył całą dziedzinę leczenia celowanego [3].

Trzeci wątek dotyczy pamięci. Prace nad CaMKII wykazały, że kinaza ta potrafi utrzymać aktywność po ustaniu bodźca, co uczyniło z niej kandydata na molekularny nośnik śladu pamięciowego — zagadnienie rozwinięte w sekcji 2.3 [1].

2. Mechanizmy i funkcje

2.1. PKA — kinaza zależna od cAMP

Kinaza białkowa A jest najlepiej poznanym przykładem enzymu sterowanego przekaźnikiem drugiego rzędu. W spoczynku występuje jako czterojednostkowy kompleks, w którym podjednostki regulatorowe blokują katalityczne. Związanie czterech cząsteczek cAMP uwalnia część katalityczną, która fosforyluje białka docelowe.

O tym, które białka zostaną zmodyfikowane, decyduje umiejscowienie. Białka kotwiczące z rodziny AKAP wiążą PKA w konkretnym miejscu komórki — przy kanale wapniowym, przy kropli tłuszczu, przy błonie jądrowej — dzięki czemu kinaza działa lokalnie, mimo że przekaźnik powstaje w całej komórce. Obrazowanie w żywych adipocytach pokazało, że pule cAMP i związana z nimi aktywność PKA są rozdzielone na kilka niezależnych przedziałów, odmiennie sterujących lipolizą [4, 5].

Konsekwencja praktyczna dotyczy interpretacji badań. Pomiar całkowitej aktywności PKA w homogenacie tkanki nie mówi nic o tym, który przedział został pobudzony — a to on decyduje o skutku fizjologicznym.

2.2. PKC — rodzina o rozbieżnych funkcjach

Kinaza białkowa C nie jest jednym enzymem, lecz rodziną kilkunastu izoform różniących się sposobem aktywacji. Izoformy klasyczne wymagają jednocześnie diacyloglicerolu i wapnia, nowe — samego diacyloglicerolu, a atypowe żadnego z nich. Wszystkie powstają w następstwie pobudzenia receptorów sprzężonych z białkiem G_q i rozkładu fosfatydyloinozytolu.

Mimo cytoplazmatycznego umiejscowienia PKC wywiera silny wpływ na jądro komórkowe. Fosforylowane przez nią białka przemieszczają się do jądra i zmieniają aktywność czynników transkrypcyjnych sterujących cyklem komórkowym, przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym i różnicowaniem komórek macierzystych [2].

Najważniejsza obserwacja praktyczna dotyczy jednak rozbieżności funkcji. Poszczególne izoformy działają częściowo przeciwstawnie — jedne sprzyjają proliferacji, inne różnicowaniu i apoptozie. Dlatego wczesne próby leczenia nowotworów przez hamowanie całej rodziny PKC zakończyły się niepowodzeniem, a kierunek badań przesunął się ku wybiórczemu wpływowi na pojedyncze izoformy [2]. Jest to zarazem ostrzeżenie wobec preparatów deklarujących „modulację PKC” bez wskazania izoformy.

2.3. CaMKII — pamięć molekularna

CaMKII zajmuje wśród kinaz miejsce szczególne, ponieważ przechowuje informację o przebytym pobudzeniu. Enzym tworzy strukturę złożoną z dwunastu podjednostek ustawionych w dwa pierścienie. Po związaniu kompleksu wapń–kalmodulina sąsiadujące podjednostki fosforylują się nawzajem w reszcie treoniny 286, a taka autofosforylacja utrzymuje aktywność również po powrocie stężenia wapnia do wartości spoczynkowej.

Powstaje w ten sposób ślad trwający dłużej niż bodziec, który go wywołał. W synapsie CaMKII gromadzi się po stronie postsynaptycznej, wiąże z podjednostką GluN2B receptora NMDA i zwiększa liczbę receptorów AMPA w błonie — na tym opiera się długotrwałe wzmocnienie synaptyczne [6].

Aktywność enzymu podlega dodatkowej regulacji przez modyfikacje reszt cysteinowych. U myszy pozbawionych zdolności do nitrozylacji CaMKII stwierdzono zaburzenia pamięci i osłabienie wzmocnienia synaptycznego odpowiadające zmianom u zwierząt starych, u których nitrozylacja tej kinazy jest obniżona [1]. Starzenie się pamięci ma zatem uchwytny odpowiednik w chemii pojedynczego enzymu, a nie tylko w ubytku neuronów.

2.4. Kinazy czujnikowe — AMPK i mTOR

Dwie kinazy pełnią funkcję czujników stanu energetycznego i pozostają wobec siebie w opozycji, przez co wyznaczają podstawowy przełącznik metaboliczny komórki.

Wzajemne hamowanie tych szlaków tłumaczy, dlaczego nie da się jednocześnie maksymalizować wzrostu tkanki i procesów naprawczych zależnych od autofagii. Jest to zarazem podłoże obserwacji wiążących restrykcję kaloryczną z długowiecznością w modelach zwierzęcych, opisanych w osobnych hasłach o AMPK i mTOR.

Warto odnotować, że najsilniejszym znanym aktywatorem AMPK jest wysiłek fizyczny, a nie żaden preparat — skurcz mięśnia zużywa ATP szybciej, niż mitochondria zdążą go odtworzyć, co bezpośrednio zmienia stosunek AMP do ATP.

2.5. Kaskady, wzmocnienie i wygaszanie

Kinazy rzadko działają pojedynczo. Najczęściej tworzą kaskady, w których jedna kinaza aktywuje kolejną, a ta następną — jak w szlaku MAP kinaz, przekazującym sygnały czynników wzrostu do jądra komórkowego. Układ taki daje trzy właściwości.

Pierwszą jest wzmocnienie: każdy poziom kaskady zwiększa liczbę zaangażowanych cząsteczek, więc kilka cząsteczek liganda zmienia aktywność tysięcy białek. Drugą jest filtrowanie szumu — kaskada wielostopniowa reaguje progowo, więc słabe, przypadkowe pobudzenia nie przechodzą dalej. Trzecią jest możliwość regulacji na wielu poziomach, co czyni układ odporniejszym na zakłócenia, ale i trudniejszym do zablokowania jednym lekiem.

Przeciwwagą dla kinaz są fosfatazy, usuwające reszty fosforanowe. Jest ich w genomie znacznie mniej, a ich swoistość jest mniejsza, przez co bywały uważane za enzymy porządkowe. Pogląd ten okazał się błędny: kalcyneuryna, czyli fosfataza aktywowana wapniem, steruje odpowiedzią limfocytów i jest celem leków immunosupresyjnych. Do tego dochodzi regulacja redoks — utlenienie reszt cysteinowych w miejscu aktywnym fosfatazy hamuje jej działanie, co przedłuża sygnał kinazowy w warunkach stresu oksydacyjnego [7].

3. Zaburzenia i modyfikacja

3.1. Kinazy w chorobie nowotworowej

Trwała aktywacja kinazy jest jednym z najczęstszych mechanizmów powstawania nowotworu, ponieważ znosi zależność podziałów komórkowych od sygnałów zewnętrznych. Zjawisko to przybiera kilka postaci: fuzji genów tworzącej białko stale czynne, mutacji punktowej znoszącej hamowanie, amplifikacji genu receptora lub utraty fosfatazy hamującej szlak.

Wspólnym problemem tej grupy leków jest oporność nabyta, powstająca zwykle w ciągu miesięcy przez mutację w miejscu wiązania leku albo uruchomienie szlaku obocznego. Odpowiedzią są kolejne generacje inhibitorów, leczenie skojarzone oraz cząsteczki kierujące kinazę do degradacji, zamiast jedynie hamować jej aktywność [3].

3.2. Kinazy w chorobach zapalnych i neurodegeneracyjnych

Poza onkologią najlepiej wykorzystywanym punktem uchwytu są kinazy JAK, przekazujące sygnał od receptorów cytokinowych. Ich inhibitory stosuje się w reumatoidalnym zapaleniu stawów, łuszczycy, atopowym zapaleniu skóry i nieswoistych zapaleniach jelit. Ceną skuteczności jest przewidywalne osłabienie odpowiedzi przeciwwirusowej, w tym zwiększone ryzyko reaktywacji półpaśca.

W chorobach neurodegeneracyjnych rolę kluczową odgrywa równowaga między kinazami a fosfatazami. Białko tau w chorobie Alzheimera jest nadmiernie ufosforylowane, między innymi przez kinazę GSK-3β, co pozbawia je zdolności stabilizowania mikrotubul i sprzyja tworzeniu splątków. Próby hamowania tej kinazy nie przyniosły dotąd wyniku klinicznego, co przypisuje się jej licznym funkcjom fizjologicznym — problem tożsamy z opisanym dla PKC [2].

Osobną grupą są kinazy zaangażowane w chorobę Parkinsona, przede wszystkim LRRK2, której mutacje należą do najczęstszych znanych przyczyn genetycznych. Inhibitory tej kinazy są przedmiotem badań klinicznych, a ich ocena wymaga kilkuletniej obserwacji, ponieważ punktem końcowym jest spowolnienie przebiegu choroby, a nie doraźna poprawa objawów.

3.3. Jak zbadać

Reguła praktyczna jest tu prosta i warto ją podać wprost: aktywności kinaz nie mierzy się we krwi. Badaniu podlega materiał z guza lub genotyp, a wynik ma sens wyłącznie wtedy, gdy istnieje lek dobrany do wykrytej zmiany.

3.4. Modyfikacja behawioralna i dietetyczna

• Wysiłek fizyczny jest najsilniejszym fizjologicznym aktywatorem AMPK, a trening oporowy — bodźcem dla szlaku mTORC1 w mięśniu; efekt zależy od rodzaju wysiłku
• Podaż białka, zwłaszcza leucyny, aktywuje mTORC1; jest to mechanizm leżący u podstaw zaleceń dotyczących białka w zapobieganiu sarkopenii
• Przerwy między posiłkami obniżają aktywność mTORC1 i sprzyjają autofagii; wielkość efektu u ludzi pozostaje przedmiotem badań
• Wyrównanie niedoboru magnezu przywraca warunki pracy wszystkich kinaz, które wykorzystują kompleks ATP z magnezem
• Ograniczenie przewlekłego stresu oksydacyjnego zapobiega hamowaniu fosfataz i nadmiernemu przedłużaniu sygnałów kinazowych [7]
• Sen — w jego trakcie zmienia się profil fosforylacji białek synaptycznych, co wiąże się z konsolidacją pamięci

3.5. Wsparcie suplementacyjne

Zastrzeżenie porządkujące. Kinazy są enzymami wewnątrzkomórkowymi, a większość deklaracji o ich „aktywacji” przez suplementy pochodzi z badań na hodowlach komórkowych, w stężeniach nieosiągalnych po podaniu doustnym. Do tego dochodzi zastrzeżenie kierunkowe: aktywacja kinazy nie jest sama w sobie korzystna — nadmierna aktywność mTORC1 sprzyja starzeniu komórkowemu, a nadmierna aktywność kinaz proliferacyjnych jest mechanizmem nowotworzenia.

Dwie uwagi praktyczne. Po pierwsze, u osób leczonych inhibitorami kinaz każdy preparat roślinny wymaga zgłoszenia lekarzowi, ponieważ wiele z nich wpływa na enzymy metabolizujące te leki, a wąski indeks terapeutyczny czyni takie interakcje istotnymi klinicznie. Po drugie, w tej kategorii szczególnie często myli się mechanizm z efektem: wykazanie wpływu na kinazę w hodowli komórkowej nie oznacza, że substancja wywiera ten wpływ w organizmie.

4. Karta praktyczna

Jak to zbadać

Aktywności kinaz nie oznacza się w surowicy. W onkologii badaniem rozstrzygającym o leczeniu jest analiza molekularna materiału z guza — wykrycie fuzji, mutacji lub amplifikacji, dla których istnieje lek celowany. W diagnostyce hematologicznej stosuje się oznaczenie mutacji JAK2, a w neurologii panele genetyczne obejmujące m.in. wariant LRRK2. Fosfoproteomika pozostaje narzędziem badawczym.

Na co uważać

• Aktywacja kinazy nie jest celem samym w sobie — nadmierna aktywność mTORC1 i kinaz proliferacyjnych jest mechanizmem chorobotwórczym.
• Preparaty roślinne u osób leczonych inhibitorami kinaz mogą zmieniać ich stężenie przez wpływ na metabolizm wątrobowy; wymaga to zgłoszenia lekarzowi.
• Inhibitory JAK osłabiają odpowiedź przeciwwirusową i zwiększają ryzyko reaktywacji półpaśca.
• Deklaracje o modulacji PKC bez wskazania izoformy są bezwartościowe — izoformy działają częściowo przeciwstawnie [2].
• Wykazanie działania w hodowli komórkowej nie przenosi się na organizm, jeśli stężenie użyte w badaniu jest nieosiągalne po podaniu doustnym.
• Najsilniejszym znanym aktywatorem AMPK pozostaje wysiłek fizyczny, nie preparat.